Del original en idioma Ingles:
Dr. Günter Scheuerbrandt
Im Talgrund 2
D-79874 Breitnau
Alemania
Tel.: +49-7652-1777, Fax: +49-7652-91813-13
e-Mail: gscheuerbrandt@t-online.de
Internet: http://www.duchenne-information.eu
Traducción y adaptación bajo permiso del autor
por:
Ricardo Rojas C.
Éste es un nuevo tipo de informe de investigación, que yo, Günter
Scheuerbrandt, un bioquímico en Alemania, he escrito para usted, niños y
jóvenes con Duchenne y sus familias, que desean saber cómo el trabajo de
científicos y especialistas en varios laboratorios de investigación del mundo
esta progresando hacia terapias eficaces para distrofia muscular Duchenne. Mis
informes anteriores, y especialmente los ultimos tres de los encuentros del
Parent-Project en Cincinnati en Julio del 2006, en Londres en el 2006, y en
Filadelfia en el 2007 (www.duchenne-information.eu),
contenían los resúmenes algo detallados de los resultados de investigación
presentados en esos encuentros. Pero como también otra investigación científica
importante es realizada sin haber sido mencionado en los encuentros, ahora he
acortado prácticamente todos los resúmenes de los tres últimos informes para
este informe, los actualicé con nueva información, principalmente del encuentro
de ActionDuchenne en Londres en Noviembre del 2007, y he añadido nuevos
resúmenes de importantes publicaciones recientes. Referencias para algunas de
las publicaciones más importantes son dadas al final de algunos resúmenes.
Éste ahora es un texto básico, que está actualizado hasta
Marzo y Abril del 2008. Lo actualizare repetidamente con nueva información, la
primera vez después del próximo encuentro del Parent-Project en Filadelfia en
Julio del 2008; estará disponible en inglés, español, y alemán algunos meses
después. Como antes, todos mis informes y éste, también, no son publicaciones
científicas con muchas palabras difíciles, porque he tratado de escribirlo para
usted en una manera que lo dejará comprender qué esta ocurriendo en los
laboratorios.
Este informe, como los anteriores, contiene los resúmenes de solamente los
resultados de investigación científica. Sin embargo, trataré de incluir también
los resúmenes sobre los nuevos procedimientos de manejo médico y social en
nuevas ediciones de este informe, sobre la base de futuras presentaciones y
publicaciones.
En los resúmenes, estoy dando solamente los nombres de los
jefes de laboratorios, aunque tienen colegas y postdoctorados y estudiantes que
trabajaban como un equipo en los proyectos reportados aquí, pero es imposible
mencionar todos sus nombres. Todos los directores del laboratorio, cuyo trabajo
es resumido aquí en este informe, han tenido la oportunidad ver los borradores
de mis textos y corregirlos, si era necesario, y casi todos lo han hecho. Por lo
tanto, no debe haber, o pocos, errores dejados en este informe.
Si usted tiene preguntas con respecto a investigación, por
favor escríbame un correo electrónico en inglés, alemán, español, o italiano.
Trataré de responder a todos ellos, pero solamente en inglés o alemán.
Guenter Scheuerbrandt, PhD., Im Talgrund 2, Breitnau de D -
79874, Alemania, correo electrónico:
gscheuerbrandt@t-online.de
Introducción
¿Cómo hacen proteínas los genes? Los genes son unidades
funcionales de material genético de ácido desoxirribonucleico, ADN. Su
estructura parece una escalera de mano entrelazada, la doble hélice. Los
niveles de esta escalera de mano constan de cuatro moléculas pequeñas
diferentes, las bases: adenina, guanina, timina, y citosina
(abreviadas A, G, T, C). Por razones espaciales, los niveles pueden contener
solamente dos tipos de combinaciones de bases, los pares de bases A-T y
G-C. Si GGCTTAATCGT es la secuencia de estas bases en una de las cadenas, la
seuencia de la cadena opuesta debera ser CCGAATTAGCA por lo tanto ambas
secuencias son complementarias una de otra:
-GGCTTAATCGT-
-CCGAATTAGCA-
Esta secuencia de bases, o de "letras genéticas", es la información genética
para el desarrollo y mantenimiento de un organismo viviente que es pasada de una
generación a la próxima.
La mayoría de los genes llevan las instrucciones para la
construcción de proteínas. En el núcleo de la célula, la instrucción
genética de genes activos es expresada, es copiada, y transcrita,
a otra sustancia genética, el ácido ribonucleico pre-mensajero o ARNpre-m,
tambien llamada la trascripción. La mayoría de los genes constan de
regiones activas, los exones, que contienen la información para la
creación de las proteínas, y los a menudo mas largos intrones, los cuales
no contienen solo "basura genetica", como una vez se penso, si no importante
informacion para el control de las actividades del gen. Después de la
trascripción, los intrones son retirados del ARN pre-mensajero, y los exones son
empalmados para formar el ARN mensajero, ARNm, que se traslada
entonces a los ribosomas, la estructura sintetizadora de proteínas fuera
del núcleo. Los ácidos ribonucleicos, los ARNs, usan la base U,
uracilo, en lugar de la similar base T del ADN. Los Sitios de empalme
son secuencias específicas dentro de los exones y en los bordes de los exones e
intrones que son esenciales para el retiro correcto de las secuencias sin
codificación del intrón del ARNpre-m. El empalmado por si mismo es logrado por
los spliceosomas, un complejo de muchas proteínas y pequeños ARN´s.
En el ARN mensajero, tres bases consecutivas, un codón,
tripleta, o "palabra genética", especifican, con tres excepciones, uno de
los 20 aminoácidos diferentes, de acuerdo con el código genético.
No hay ningún espacio entre los codones. En los ribosomas, el código de palabras
genéticas del ARN mensajero es leído y traducido en el lenguaje de las
proteínas, las cuales están construidas de muchos, a menudo miles, de
aminoácidos, sus componentes de construcción. Las tres excepciones mencionadas
son las tripletas UAA, UAG, y UGA, que son codones de parada, donde el
ensamblaje de la proteína se detiene.
El gen y la proteína distrofina: Las distrofias musculares Duchenne y
Becker son causados por una mutación o daño del gen de la distrofina que
lleva la información para las diferentes formas de la proteína distrofina.
Con una secuencia de 2, 220,223 bases, es con mucho el gen humano conocido más
grande. Solamente 11,058 bases, el 0.5 %, en los 79 exones del gen de la
distrofina especifica la secuencia de los 3,685 aminoácidos de la proteína
distrofina “normal” en las celulas musculares.
El tamaño del gen y la proteína distrofina: La estructura de doble hélice
del gen de la distrofina tiene 0.75 mm de largo. Junto con los otros cerca de
25,000 genes humanos, esta empacado en un núcleo celular de un diámetro de cerca
de 0.01 mm solamente porque el material genético esta empacado muy
apretadamente. Una molécula de distrofina de extensión completa es mucho más
corta que su gen, de 125 nm (= 0.000125 milímetros) de largo, 80,000 de ellos
colocados extremo con extremo en una línea recta cubriría sólo un centímetro. Y
en un gramo de músculo, hay 114 mil millones moléculas de distrofina. Esto puede
ayudar a apreciar la tarea de los científicos: parar detener la enfermedad, para
hacer que los músculos funcionen otra vez, al menos cerca del 30% del número
normal de las distrofinas tienen que aparecer otra vez después que el gen dañado
no puede hacerlas más. Las nuevas distrofinas no tienen que tener la misma forma
exactamente, pueden ser más pequeñas, pero deben poder trabajar apropiadamente.
¡Y eso quiere decir que miles de millones de nuevas distrofinas tienen que
volver a cada gramo de músculo, y un niño tiene muchos kilogramos de ellos!
El papel de distrofina: La distrofina es necesaria para la estabilidad
mecánica de las células musculares. Está ubicada en el interior de las membranas
de la célula muscular. Uno de sus extremos, la terminal-C, está unido a
un grupo de otras proteínas en la membrana, el complejo
distrofino-glicoproteico, y el otro extremo, la terminal-N, se
conectan a las estructuras contráctiles dentro de las células musculares. La
parte central de la distrofina, dominio de varilla (rod domain), consta
de cadenas de aminoácidos enroscadas que se doblan sobre si mismas varias veces.
Si el movimiento de contracción de la célula muscular forza a la proteina
distrofina a cambiar su longitud, su estructura doblada permite que ella actúe
como un resorte o como un absorbedor de choques. Por lo tanto, la
distrofina transmite la energía mecánica producida por el "aparato de
contracción" de actina-miosina hacia las membranas de la célula muscular y
las estructuras fuera de los músculos, el tejido conectivo y los tendones, en
una manera equilibrada que no los somete a demasiado esfuerzo.
La distrofina tiene más papeles: organiza la compleja estructura del complejo
distrofino-glicoproteico y la ubicación de muchas otras proteínas. También
regula procesos complicados como el mantenimiento de la cantidad correcta de
calcio en las células y aquellas sustancias que controlan el crecimiento de los
músculos. Muchos detalles de estas interacciones intrincadas entre numerosos
componentes en una célula viviente todavía son desconocidos.
Los chicos Duchenne no tienen o tienen muy poca distrofina en
sus fibras musculares. Cuando sus efectos protectores y organizadores están
faltantes, la contracción del músculo causa la ruptura de las membranas
musculares, y esto permite que cantidades grandes de calcio circulen en las
fibras. El excesivo calcio activa enzimas como la calpaína y otras
proteasas que deshacen las proteínas musculares e inician programas de muerte
celular, apoptosis. Las consecuencias son una cadena de los eventos como la
inflamación y la activación de fibroblastos que resultan en fibrosis,
tejido cicatrizante, que disminuye la velocidad de regeneración del músculo y
causa los típicos síntomas de los pacientes con Duchenne mayores.
Los chicos con distrofia Becker de progresión más lenta
mayormente tienen cantidades menores a lo normal de distrofina y a menudo
también más corta de lo normal. Esta todavía puede cumplir su papel, pero no
trabaja tan eficazmente como la versión normal.
Pero no solamente los músculos esqueléticos sufren cuando la
distrofina está faltante, sino también los músculos lisos y cardiacos. . El daño
para los músculos de corazón causa cardiomiopatía, y la debilidad de los
músculos lisos tiene muchas consecuencias, entre otros la habilidad reducida de
los vasos sanguíneos a relajarse cuando el flujo de sangre aumenta resultando en
problemas respiratorios y otros, y también el tracto gastrointestinal es
afectado cuando la motilidad de los intestinos es reducida. Así que el cambio en
sólo un gen puede afectar todo el cuerpo.
Las mutaciones del gen de la distrofina: Hay tres tipos de mutaciones del
gen de la distrofina: deleciones, si uno o mas exones enteros del gen
están faltantes, duplicaciones, si partes del gen están repetidas, y
mutaciones puntuales, si un solo par de bases esta cambiado, eliminado o
añadido. Otras son inversiones y mutaciones en los intrones que modifican los
patrones normales de empalmado.
Como los codones de tres letras del ARN mensajero son leídos
en los ribosomas uno después de otro sin interrupción, este marco de lectura
no es alterado, cuando la mutación elimina o añade codones enteros de tres pares
de bases por vez. En este caso, el marco de lectura se mantiene en orden
y la distrofina puede ser hecha todavía pero esta será más larga o más corta de
lo normal.. Si este cambio afecta solamente estructuras no-esenciales de la
distrofina, puede ser en parte funcional y por lo tanto, da lugar a distrofia
Becker menos severa.
Sin embargo, si la mutación cambiara el marco lectura por uno
o dos pares de bases, el marco de lectura pierde su orden. Entonces, un
número de aminoácidos incorrectos son incorporados en la proteina empezando en
el sitio de la mutación hasta que finalmente un nuevo y prematuro codón de
parada es alcanzado. La distrofina incompleta no puede cumplir su función
normal, desaparece y la distrofia muscular Duchenne se desarrolla.
La distrofina en el cerebro. La distrofina no sólo esta presente en las
fibras músculares sino también en otros órganos como el cerebro y la retina de
los ojos. La distrofina en el músculo con un peso molecular de 420 kd,
kilodaltons (420,000 veces más pesado que un átomo de hidrógeno) es la más
grande de cinco isoformas (proteinas de tamaño diferente). En el cerebro,
esta distrofina normal, asi como también las cuatro más pequeñas, son
encontradas predominantemente en las sinapsis, donde las células nerviosas se
conectan unas con otras, y en las paredes de los vasos sanguíneos en el cerebro,
en la asi llamada barrera sanguinea-cerebral. Esto significa que estas
distrofinas son importantes para la comunicación entre los nervios y también
para la correcta actividad de la barrera sanguinea-cerebral que deja pasar
solamente aquellas sustancias que son necesarias para la función normal del
cerebro.
El gen de la distrofina tiene siete promotores, las
secuencias de bases en las que la biosíntesis de proteina es iniciada. Los
primeros tres promotores al principio del gen controlan la síntesis de la
proteina normal, los otros cuatro están más dentro del gen. El promotor más
cerca al final del gen produce una distrofina mas corta. Esto significa, que las
mutaciones que han ocurrido antes de ese promotor en particular no afectan la
producción y la estructura de la proteina iniciadas por ese promotor. Por
ejemplo, los chicos con Duchenne con mutaciones en la primera mitad de su gen
todavía pueden producir sus isoformas acortadas de distrofina para el cerebro,
en contraste con aquellos con mutaciones en las últimas regiones del gen, cuyas
distrofinas cerebrales estarán entonces también ausente. Este explica por qué
algunos niños con Duchenne tienen significantes dificultades de aprendizaje y
comportamiento, y otros niños solamente algunos o ningunos en absoluto.
Ya que isoformas diferentes de distrofina también han sido
encontradas en la retina del ojo, la ubicación de la mutación al parecer es
responsable de las dificultades de visión del color de algunos niños con
Duchenne.
Comunicado por Profe. Francesco Muntoni del
Colegio Imperial en Londres.
Omisión de Exón
La omisión de exón no es una cura. La técnica de omisión de exón
(exon skipping, salto de exón) trata de disminuir la velocidad de la rápida
distrofia Duchenne a una distrofia Becker mucho más leve. Esta no cambia al
gen mismo con su mutación, pero afecta cómo es leído y procesado el gen
defectuoso. La omisión de exón no será una cura para distrofia Duchenne,
solo debe reducir la gravedad de sus síntomas, es solamente una terapia.
Si una mutación, una deleción, duplicación o mutación
puntual, altera el marco de lectura del ARN mensajero, ARNm, y causa por lo
tanto distrofia Duchenne, el marco puede ser restaurado retirando
artificialmente del ARNm uno o mas exones con oligorribonucleótidos en
antisentido, AONs. Son pequeños trozos de ARN cuyas secuencias son diseñadas
en tal manera de que se unen por si mismos precisamente a la secuencia
complementaria del ARNpre-m dentro del exón a ser retirado o en sus regiones
fronterizas, y en ningún otro lugar. Estos AONs por lo tanto interfieren
en la maquinaria de empalmado con el propósito de que el exón o exones
seleccionados no sean más incluidos en el ARNm, son omitidos.
Como a este ARNm es más corto de lo normal, la proteína distrofina es también
más corta, contiene menos aminoácidos. Si los aminoácidos faltantes son parte de
regiones no-esenciales, como el dominio de varilla (rod domain), la proteína más
pequeña puede a menudo todavía realizar su papel estabilizador en la membrana
celular del músculo. El resultado sería el cambio de los síntomas de Duchenne
severos en los síntomas mucho más leves de distrofia muscular Becker.
Para las primeras pruebas de omisión de exón, dos clases de
AONs químicamente protegidos son usadas. Tienen que ser protegidos porque son
destruidos lentamente en las células musculares por enzimas destructoras del
ácido nucleico. Los dos tipos de AONs son los 2'O-metil-fosforotioatos,
también llamados 2O-metilos y los morfolinos.
Prueba de omisión de exón en Holanda. La primera prueba en humanos con
la técnica de omisión de exón fue realizada en Holanda entre enero del 2006
y marzo del 2007. Fue diseñada para proveer solamente una prueba de principio
y no un beneficio terapéutico a los niños tratados. Fue un estudio local sobre
un área pequeña de un solo músculo, el músculo de la espinilla tibialis
anterior, que fue tratado con un oligorribonucleótido en antisentido
2’O-metilo, AON, contra el exón 51 llamado PRO051. Con este tipo de AON
químicamente protegido, los investigadores holandeses habían trabajado en
experimentos pre-clínicos por varios años y fueron capaces de omitir los exones
de la distrofina con éxito en fibras musculares no sólo en cultivos de células,
sino también en ratones y perros vivos después de inyecciones locales y
sistémicas.
Antes del inicio de esta primera prueba clínica de omisión de
exón, pruebas clínicas y genéticas moleculares fueron llevadas a cabo en cada
niño para asegurarse de que el procedimiento de omisión de exón en los niños
produjera distrofina acortada tipo Becker de la estructura esperada. Cuatro
chicos, que ya usan silla de ruedas, participaron en este estudio de método
abierto. Tienen entre 10 y 13 años de edad y habían demostrado deleciones de los
exones de la distrofina 50, 52, 48-50, y 49-50. Fueron tratados en secuencia,
esto significa que solo después de que los resultados en un chico eran positivos
y no mostraban ningún efecto secundario serio, el próximo chico era tratado.
Cada chico recibió cuatro inyecciones de 0.2 mg de PRO051 disuelto en 0.2 ml de
solución salina (0.9% NaCl) bajo anestesia local, en una región pequeña de 1.5
cm de extensión del músculo tibialis anterior.
Después de cuatro semanas, tejido muscular fue obtenido por una biopsia del
sitio de la inyección y se probó para buscar el ARNm omitido y distrofina
acortada esperada. Estas pruebas mostraron que el 64%, 85%, 97%, y 73% de las
fibras musculares todavía presentes en el músculo distrófico, contenían nueva
distrofina en sus membranas después de este tratamiento de 4 semanas. En
comparación con la laminina α2, una proteína no afectada por el proceso
distrófico, el contenido de distrofina fue de 33%, 35%, 17%, y 25%. Esta
comparación tiene en cuenta la extensión de la degeneración muscular. Sin este
ajuste el chico de 13 años con mucho tejido conectivo y grasa en sus músculos
tenía solamente 3% de la cantidad normal de distrofina, mientras que el chico
con los músculos menos afectados tenía 12%. Los métodos moleculares de
secuenciación probaron que la nueva distrofina tenía exactamente la estructura
esperada con un marco de lectura restaurado. Fue imposible determinar si la
cantidad de nueva distrofina habría sido capaz disminuir la velocidad de
progresión de la enfermedad en el músculo entero, porque el volumen de tejido
muscular tratado era demasiado pequeño.
Estos resultados significan que un tratamiento de omisión de
exón, cuando este disponible, debe empezar cuando la mayoría de los músculos
todavía están intactos, esto es, apenas la mutación precisa de la distrofina sea
conocido causa un cambio del marco de lectura.
Los investigadores holandeses ahora han empezado una
fase-I/II de estudio clínico para explorar el efecto, seguridad, tolerancia y
posibles efectos secundarios de inyecciones sistémicas del AON PRO051 en
la circulación sanguínea, para que así pueda alcanzar todos músculos, incluyendo
aquellos del pulmón y corazón. Esta prueba es realizada en colaboración con la
Universidad de Leuven en Bélgica, el Centro Medico de la Universidad de Leiden y
el Hospital Infantil Reina Silvia en Suecia. Los pacientes son ahora enrolados.
Las inyecciones serán hechas subcutáneamente (bajo la piel) porque ha sido
mostrado con ratones y monos que este tipo de aplicación causa omisión de exón
sin efectos secundarios serios en todos los músculos probados, también en el
corazón y el diafragma, y porque no requeriría visitas frecuentes a los
consultorios médicos y hospitales si tratamientos repetidos son necesarios.
Esta técnica de omisión de exón con los AONs 2’O-metilos fue
desarrollada en la Universidad de Leiden por el Prof. Gertjan van Ommen,
la Profa. Judith van Deutekom y su equipo, pero para la
organización y realización de las pruebas clínicas, la compañía Prosensa B.V. en
Leiden con su presidente Dr. Gerard Platenburg es ahora
responsable. La Profa. van Deutekom es ahora jefa de investigación de Prosensa.
El estudio sistemico será hecho en doce niños con Duchenne de
5-15 años y durará cinco semanas con una inyección subcutánea cada semana.
Debido a que no ha sido probado que las dosis de AON usadas en los estudios
animales serán seguras de usar en niños, uno empezará la prueba sistémica con
una dosis muy baja que será incrementada lentamente para acercarse a un nivel
óptimo, de inicialmente una inyección de 0.5 mg/kg, a un máximo de 10 mg/kg.
Prosensa ya ha producido grandes cantidades del AON contra el
exón 51 en calidad grado clínico para la próxima prueba. También, AONs con
estructuras optimizadas en contra de los exones 43, 44, 45, 46, 50, 52 y 53 han
sido preparados. Estos AONs juntos, incluyendo el AON anti exon 51, permitirán
el tratamiento de más del 65% de todos los pacientes con deleciones. Pero, por
razones financieras, Prosensa está desarrollando actualmente solamente los AONs
contra los exones 44 y 52 hacia la aplicación clínica completa y mercadeo.
La compañía necesita más capital de inversión para el desarrollo de otros AONs y
aprecia la financiación cuantiosa recibida de las organizaciones de padres como
los Parent Projects Holandés y Alemán, la asociación de distrofia muscular
francesa AFM y otras.
Van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, et al. Local
dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med 2007;
357; 2677-86.
Hoffman, EP. Skipping toward personalized molecular medicine. N Engl J Med 2007;
357; 2719-22.
Prueba clínica de omisión de exón en el Reino Unido. Otra prueba clínica
de omisión de exón está siendo realizada en el R.U. por el Consorcio MDEX
bajo la dirección del Prof. Francesco Muntoni del Colegio Imperial
de Londres. El consorcio MDEX, financiado por el departamento de Salud, agrupa a
nueve investigadores así como las sociedades benéficas Muscular Dystrophy
Campaign, ActionDuchenne, y Duchenne Parents Support Group.
Ocho oligos en antisentido diferentes, AONs, fueron probados
en cultivos de músculo humano normal y con Duchenne y en ratones no distroficos
los cuales tenian genes de la distrofina humana. Los mejores resultados fueron
obtenidos con el AON morfolino H51A desarrollado por Steve Wilton,
en Perth (Australia) y mostrado por Dominic Wells en Londres que
era suficientemente estable para un tratamiento a largo plazo. Este AON
morfolino está siendo fabricado en grado clínico por la compañía AVI BioPharma
Inc. en Portland, Oregón, y es llamado AVI-4658.
Tres grupos de tres chicos con Duchenne cada uno, de 12 a 18
años de edad y que no pueden caminar mas, recibiran Tres dosis diferentes: 0.09,
0.297, y 0.9 mg de AON morfolino en 0.9 ml de solución salina, con nueve
inyecciones directamente en los músculos extensores brevis digitorum en
el exterior de un pie. Este musculo fue seleccionado porque es muy accesible y
puede ser retirado sin serias consecuencias si algunos efectos secundarios
inaceptables ocurrieran. El músculo del otro pie recibe inyecciones de solución
salina para pruebas de control. Chequeos clínicos extensivos incluyendo biopsias
serán hechos antes y 30 día después de las inyecciones.
Después de que la aprobación fue dada por todas las tres autoridades reguladoras
del R.U. después de un largo proceso de aplicación, el primer niño recibió sus
inyecciones de AON el 18 diciembre del 2007. Los resultados del estudio entero
se espera sean informados durante el 2008.
Tan pronto como esta primera prueba muestre resultados
prometedores, un estudio sistémico, que está ya en un estado de planificación
avanzado, empezará con inyecciones subcutáneas del AON AVI-4658 en la
circulación sanguínea. Uno de los más decisivos experimentos animales
pre-clínicos para la preparación de esta prueba, fueron siete inyecciones
semanales de AON en el vena de la cola de ratones mdx que resultaron en más del
50 % de la cantidad normal de distrofina en la mayoría de sus músculos, que
estaba presente durante al menos 14 semanas.
En esta prueba sistémica, se planea tratar a cuatro grupos de
niños con Duchenne ambulantes con inyecciones sistémicas subcutáneas semanales,
empezando con una dosis baja de AON de aproximadamente 600 mg e incrementándose
a aproximadamente 3 gramos, calculado para un niño de aproximadamente 10 años.
En pruebas clínicas previas para otras enfermedades, dosis de AON de hasta 300
mg/kg/día fueron bien toleradas, así que la dosis de inicio en esta prueba de
Duchenne era muy baja. Los objetivos de la prueba son hacer pruebas para
seguridad y tolerabilidad y también cambios de la función muscular y fuerza. Y
es esperado que con una dosis baja pueda ser determinado si inducirá suficiente
omisión de exón mientras sea bien tolerado por los niños sin efectos secundarios
serios.
La descripción detallada de la prueba clínica local puede ser
vista en
http://clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00159250
Arechavala-Gomeza V, Graham IR, Popplewell LJ, et al. and Muntoni F. Comparative
analysis of antisense oligonucleotide sequences for targeted skipping of exon 51
during dystrophin pre-mRNA splicing in human muscle. Human Gene Therapy, 2007;
18; 798-810.
Omisión de Exón con transferencia de gen U7: Los investigadores en el
Instituto Généthon en Evry cerca de París, el Prof. Luis García y
la Dra. Aurélie Goyenvalle (ahora en la Universidad de Oxford)
están tratando de combinar la omisión de exón con terapia génica al
ordenar a las células musculares que produzcan los oligorribonucleótidos en
antisentido, AONs, para que no tengan que ser inyectados repetidamente. Esto
puede ser conseguido transportando dentro los músculos ARNsn’s-U7 modificados
conteniendo la información genética para la construcción de los AONs. Los
ARNsn’s-U7 son ARN’s nucleares pequeños, que tienen una estructura similar a
los factores empalme. Con un segundo programa de investigación, los científicos
franceses han desarrollado una nueva técnica de omisión de exón más general que
también usa la transferencia viral de genes U7.
Para probar el primer enfoque, un gen modificado para el
ARNsn-U7 fue construido añadiendo secuencias complementarias de ADN para dos
AONs que son necesarios para omitir el exón 23 de ratones mdx. Estos ARNsn’s,
como todos los otros ARN’s, también son "hechos" por genes. Este gen-U7
modificado, U7 SD23/BP22, junto con secuencias de control, fue insertado en los
vectores AAV tipo 2 e inyectado primero a nivel local en músculos solos de
ratones mdx y luego sistémicamente en su circulación sanguínea. Esto resultó en
la aparición de distrofina sin los aminoácidos determinados por el exón 23 en
hasta 80 % de las fibras musculares tratadas, esta nueva y acortada distrofina
migro a su normal posición debajo de las membranas celulares del músculo, y fue
estable por más de un año sin causar alguna reacción inmune. Los procesos
distróficos en los músculos mdx, esto es, su acelerada degeneración y
regeneración, fueron interrumpidos totalmente. Los ratones mdx sistémicamente
tratados que fueron físicamente estresado corriendo sobre una cinta rodante
cuesta abajo, no desarrollaron el daño muscular usual encontrado en ratones mdx
sin-tratar.
Esta técnica de transferencia del gen-U7 fue aplicada luego
para tratar el perro clínicamente distrófico perdiguero dorado GRMD.
Estos perros tienen una mutación en el sitio de empalme del exón 7 y puede ser
"reparado" omitiendo los exones 6 y 8. Usando un vector U-7 modificado que
contiene estructuras en antisentido en contra de los exones 6, 7, y 8,
distrofina acortada en casi el nivel normal fue obtenida dos meses después de
una sola inyección local en un músculo. Una inyección sistémica regional en una
pata con la circulación bloqueada resultó en grandes cantidades de nueva
distrofina que todavía estaba presente seis meses después.
En el segundo enfoque basado en la transferencia del gen U7,
la omisión de exón será mediada por un nuevo y casi "universal" vector ARNsn-U7,
que trae una secuencia de ADN complementaria al exón y una cola libre que tiene
sitios de unión para las ribonucleoproteinas nucleares heterogéneas A1/A2
(hnRNP), proteínas que inhiben el proceso de empalmado para todos los exones. La
secuencia complementaria del gen transferido, una vez transcrito en un ARN
pequeño, se unirá al exón a ser omitido, y vendrá con la estructura atrayente de
los hnRNPs, que inducirá la omisión de exón porque estas proteínas interfieren
con el complejo de proteínas de empalmado, los spliceosomas, asentándose en los
extremos de este exón en particular en el ARNpre- m. Por lo tanto, esta clase de
omisión de exón no es provocado por los AONs usuales si no por estas proteínas
"universales" que hacen la misma inhibición del empalmado de todos los exones.
Este método ya ha sido probado con éxito en el laboratorio para la omisión del
exón 51 en mioblastos aislados de pacientes con Duchenne.
La razón para este enfoque es acortar considerablemente el
largo proceso de aprobación posiblemente requerido para muchos o incluso todos
los AONs usados por las técnicas normales de omisión de exón, porque el nuevo
enfoque usa solamente la estructura "universal" de cola en adición con la
secuencia complementaria de ADN de la secuencia del exón a ser omitido.
Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, et al, and Garcia L, y
Danos O. Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping.
Science 2004; 306; 1796-99.
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Acercamientos de Investigacion para una Terapia de Distrofia Muscular Duchenne