Del original en idioma Ingles:
Dr. Günter Scheuerbrandt
Im Talgrund 2
D-79874 Breitnau
Alemania
Tel.: +49-7652-1777, Fax: +49-7652-91813-13
e-Mail: gscheuerbrandt@t-online.de
Internet: http://www.duchenne-investigacion.com
De la Conferencia del Parent Project UK Muscular Dystrophy:
Epicentre, 41 West Street, London E11 4LJ, RU
Tel.: *44-20 8556 9955,
e-mail: nick@ppuk.org, internet: www.ppuk.org
Traducción y adaptación bajo permiso del autor
por:
Ricardo Rojas C.
Standing on the Shoulders of Giants – Parándose en los Hombros de los Gigantes
Este era el título de la 4ta conferencia internacional del Parent Project
Muscular Dystrophy del Reino Unido (PPUK) que tuvo lugar 21 y 22 de Octubre del
2006 en Londres. Treinta científicos y médicos de enfermedades musculares
presentaron y hablaron de sus más recientes resultados de investigación,
pruebas clínicas en curso y planeadas, métodos de manejo médico actualizado, y
registro en base de datos. A mi, Günter Scheuerbrandt, un bioquímico de
Alemania, se me pidió por Nick Catlin, presidente del PPUK, escribir este
informe para usted, los niños y sus familias, que desean estar al tanto de cada
paso exitoso en este camino a un tratamiento eficaz. Como yo no soy un experto
medico, el informe contiene 23 resúmenes de solamente las presentaciones
científicas, 16 de los científicos presentes en la reunión, 2 de científicos
que no pudieron asistir, y 5 de otros investigadores que no estaban en la
reunión pero cuyo trabajo es igualmente importante para el desarrollo de las
terapias para Duchenne.
Todos los científicos cuya investigación es resumida, han tenido la oportunidad
ver el borrador del resumen de sus presentaciones y corregirlo si era necesario,
y todos han lo hecho, por lo tanto, debe haber pocos errores. Otra consecuencia
es que incluso son reportados resultados que fueron obtenidos entre la
conferencia y escribir este informe en enero del 2007.
Después de la reunión anual del Parent Project Muscular Dystrophy de EUA en
Cincinnati/Ohio del 13 al 16 de julio del 2006, he escrito un informe similar
que puede ser visto en Internet en www.duchenne-research.com. Los dos informes
vienen juntos y ambos no son publicaciones científicas, son escritos para usted,
los niños y sus padres, en una lengua que usted debe ser capaz comprender.
En general, estoy usando los nombres de los científicos sin sus títulos, la
mayoría son profesores y todos tienen un Postgrado o un título en Medicina o
ambos. Y casi todos son jefes de laboratorios, eso quiere decir que tienen
colegas y postgraduados y estudiantes que trabajaban como un equipo en los
proyectos reportados aquí, pero es imposible mencionar todos sus nombres.
Alrededor de 140 años después de la descripción de Guillaume Duchenne de
Boulogne y 20 años después de que Louis Kunkel aisló su gen, el gen de la
distrofina, esta enfermedad terrible que es la distrofia muscular Duchenne, está
soltando su grillete lentamente, esto es obvio después de las presentaciones de
tantos nuevos resultados de investigación en estas dos reuniones. La distrofia
muscular Duchenne está siendo conquistada paso a paso por tantas personas
dedicadas que trabajan para nosotros en muchos países. Los dos informes están
mostrando por qué es así.
Introducción de Nick Catlin: Parándose en los Hombros de los Gigantes
En 1675, Isaac Newton escribió a Robert Hooke que para hacer grandes avances en
la ciencia debemos pararnos en los hombros de los Gigantes. Por supuesto estaba
siendo muy humilde y quizás haciendo hincapié a Hooke que debía tomar mas tiempo
a estudiar a personas como Copernico, Kepler y Galileo que frecuentar los cafés
de Londres. Durante esta conferencia somos muy privilegiados de tener algunos de
los científicos exponentes que han hecho descubrimientos esenciales que han
abierto las posibilidades para las nuevas terapias génicas para distrofia
muscular Duchenne. Por más de 100 años desde la primera descripción de la
enfermedad por Duchenne, teníamos pocos conocimientos de las causas de la DMD.
En 1986, éste es el 20 aniversario, la estructura de gen de la distrofina fue
descubierta por Luis Kunkel, Anthony Mónaco, Kay Davies, Eric Hoffman y otros.
Sin su trabajo tendríamos poca esperanza de encontrar hoy una cura para
Duchenne.
Hubo una gran oleada de optimismo que siguió inicialmente al descubrimiento de
la estructura de gen. Pero en 20 años hemos perdido otra generación de chicos
debido a esta terrible enfermedad deteriorante del músculo. Un general
pesimismo profundo empezó en la época en que mi hijo Saul fue diagnosticado en
el 2000. Sociedades benéficas y científicos se atrevieron a no hablar de curas
o tratamientos a los padres e incluso el uso de corticoides todavía no era
común. Muchos científicos habían dejado el campo de investigación de Duchenne
cuando la financiación se secó y las enfermedades neuromusculares parecía se
olvidaron en la pelea mundial contra el cáncer, el SIDA y otras enfermedades
que afectan grupos más grandes de la población del mundo. Sin embargo los
grupos dedicados de investigadores, científicos y médicos y padres han peleado
en tratar de superar una enfermedad devastadora que resulta en la parálisis
total y la muerte temprana. También sabemos que muchos niños jóvenes están
también afectados por problemas relacionados de aprendizaje y conducta.
Para mí y el PPUK el punto decisivo más importante vino cuando obtuvimos 1.6
millones de Libras de financiación del Ministerio de Salud en el 2003 para el
consorcio de MDEX del R.U. de omisión de exón. Esto era un momento crucial en
relación con nuestro gobierno por fin haciéndolo consciente de las necesidades
de familias con Duchenne y suministrando importante financiación para un
proyecto de investigación de terapia génica muy importante. El consorcio MDEX
de médicos y científicos ha abierto nuevas vías en investigación colaborativa y
tenemos grandes esperanzas para la primera terapia génica para DMD. Desde
entonces otras pruebas clínicas han proliferado y ahora tenemos compañías de
biotecnología como VASTox en el R.U., Prosensa en Holanda, PTC y AVI del USA, y
Santhera en Suiza que no solamente añaden proyectos para Duchenne a sus
portafolios si no viendo como conducen los principales desarrollos de proyecto.
Esta tendencia de nuevos proyectos de investigación y pruebas clínicas
adicionales al parecer continuara en el 2007. El MYOAMP ha sido fundado de una
gran financiación europea para acelerar los avances prometedores en la terapia
de células madre de músculo. Para tratar enfermedades neuromusculares ha
asegurado 10 millones de euros de presupuesto para poner juntos nuevas redes de
científicos y médicos para promover una mejor practica clínica y acelerar las
pruebas clínicas. El PPUK a través de los esfuerzos estupendos de muchas
familias con Duchenne del R.U. ha financiado ahora seis proyectos clave con
cerca de 300,000 libras en sociedad con nuestros grupos internacionales de
Parent Project en Francia y Mónaco.
Pero este no es momento de recostarse y esperar. Nuestras familias deben
comprender la necesidad urgente de redoblar nuestras campañas y esfuerzos de
recaudación de fondos si vamos a salvar esta generación de niños con esta
enfermedad devastadora. Tenemos que dar nuestra inspiración y esperanza a esos
científicos que han preparado el terreno para el progreso que está siendo hecho
hoy. También tenemos que pararnos en los hombros de gigantes como Pat Furlong
en EUA, que se ha negado a dejar la pelea para curar la DMD a pesar de perder a
sus propios dos hijos. Fue Christopher Furlong quien le dijo antes de morir "Si
tu no luchas por una cura mamá, nadie más lo hará”
Veinte Aniversario: Descubriendo el gen de la distrofina y su proteína.
En 1980, Louis Kunkel empezó el trabajo como un compañero postdoctorado en el
laboratorio de Samuel A. Latt en el Hospital Infantil de la Universidad de
Harvard en Boston con la intención de encontrar finalmente la causa de la
distrofia muscular Duchenne, 118 años después que el Dr. Duchenne en París
describió correctamente esta enfermedad hereditaria más frecuente de la
infancia. Él pidió a la Asociación de Distrofia Muscular de EUA, MDA, financiar
este proyecto, pero ellos no creyeron que él realmente pudiera encontrar el gen
defectuoso de la DM Duchenne, entonces él les dijo como planeaba hacerlo: (1)
Mapear el gene, es decir encontrando donde exactamente está en el cromosoma X;
(2) comprobar que tanto y como estaba mutado, o dañado, en pacientes con
Duchenne; (3) identificación de las secuencias codificadas, aquellas varias
cadenas separadas de letras genéticas, los exones, que contienen la información
para hacer una proteína; (4) juntar estos exones, es decir, haciendo el llamado
ADNc que consiste en estas partes activas del gen; (5) predicción de la
secuencia de aminoácidos de la proteína con la ayuda del código genético; y (6)
finalmente aislamiento de la proteína. Eso convenció a la MDA, y Louis consiguió
el dinero.
En esta reunión, Louis Kunkel describió estos pasos, que lo llevó a su objetivo.
En ese momento, hace un cuarto de siglo, era mucho más difícil y consumía más
tiempo que hoy aislar un gen y luego pronosticar y encontrar su proteína. Aquí
están, muy abreviados, los pasos tomados para descubrir el gen:
Era sabido que el gen Duchenne debía estar en el cromosoma X, porque - con
excepciones muy infrecuentes - solamente los varones desarrollan la enfermedad y
sus madres son a menudo las portadoras genéticas. Kay Davies y Bob Williamson
separaron el cromosoma X entero de los otros usando nuevas técnica. Marcadores
fueron encontrados, pequeñas secuencias o etiquetas genéticas, que permitían
determinar con precisión la posición del gen en el cromosoma en relación con los
muchos otros genes. Ya en esta etapa se descubrió, que había solo un gen para la
distrofia Duchenne y Becker. Y con Gertjan van Ommen, los métodos para
diagnosis tempranas y prenatales fueron desarrollados, lo que hizo entonces aun
el asesoramiento genético mucho más preciso.
Entonces algunos pacientes inusuales ayudaron acercarse al gen Duchenne aun más
lejos. Había una mujer que tenía síntomas de Duchenne. Ronald Worton descubrió
que una pequeña pieza del brazo corto de su cromosoma X se había unido a un
cromosoma 21 acortado, y le faltaba un trozo al cromosoma 21 que estaba ahora
ubicado en donde el cromosoma X había perdido esa parte de su estructura. Por lo
tanto, una translocación, un cambio del material del cromosoma había ocurrido en
todas sus células. Los científicos podían ver estos cromosomas cambiados bajo
el microscopio, por lo tanto, podían localizar el punto de ruptura. Y porque
el paciente de sexo femenino tenía síntomas de Duchenne, este punto de ruptura
debía haber estado dentro del gen Duchenne y por lo tanto afectandolo y
desactivandolo.
Entonces apareció un niño que tenía distrofia Duchenne y también otras tres
enfermedades con el mismo modo de herencia. Así que con Uta Francke, pudo ser
mostrado que todos los tres genes estaban perdidos, había una supresión muy
grande en el cromosoma X que podía ser visto. Otros pacientes aparecieron con
supresiones más pequeñas también cerca de donde el gen Duchenne se suponía
debía estar. Entonces muchas piezas de material del cromosoma normal que
representaba las regiones eliminadas estaban aisladas, y entre ellas una,
llamada PERT87, que actualmente detecta supresiones en 5 % de los niños con
Duchenne. Muchos más investigadores empezaron a trabajar con esta corta
secuencia cromosómica que a través de su muy específico emparejamiento de bases
de ADN uniéndose por si misma a la secuencia complementaria dentro del gen
Duchenne y en ningún otro lugar. Pero esto pasaba solo si la secuencia objetivo
estaba ahí; si no estuviera ahí, suprimida o delecionada, la PERT87 no podía ser
encontrada y por lo tanto, los científicos podían distinguir a pacientes con y
sin una supresión en ese lugar.
Louis Kunkel con su equipo en crecimiento colecto todos los datos de sus
colegas y finalmente pudo analizar los detalles genéticos de los 1,346 pacientes
con Duchenne y Becker, todavía el más grande estudio de esta clase. Debido a
que el 8.7 % de los pacientes tenían una supresión en el sitio PERT87, el gen
Duchenne tenía que estar ahí. Debido a que este gen es muy importante no sólo
para los humanos sino también para todos otros animales con músculos,
experimentos similares con la PERT87 fueron hechos en músculos de ratones,
pollos, y monos, y efectivamente, este gen fue conservado durante la evolución.
Finalmente, clones o copias fueron hechas de la zona alrededor del sitio PERT87
hasta que todas las secuencias de codificación, los 79 exones del gen, fueron
identificadas.
Así que, seis años después que el Dr. Kunkel empezó su trabajo, en 1986, él y
sus colegas lo habían hecho realmente, ellos tenían el gen con, como es ahora
conocido, exactamente 2,220,223 nucleótidos o letras genéticas. Es con mucho el
más grande de los aproximadamente 22,000 genes humanos, representando el 0.1 %
del genoma entero, y todavía no es conocido por qué es necesario que tal gen sea
tan grande.
De la secuencia del ADNc y con ayuda del código genético, Michel Koenig y otros
en el laboratorio de Kunkel pudieron pronosticar la estructura de la proteína
cuya producción es controlada por este gen. Tenia que ser una cadena de
proteína con forma de varilla de 3,685 aminoácidos. ¿Pero dónde estaba ubicada?
Junto con Eric Hoffman y Kevin Campbell, dos grandes secuencias de codificación
de varios exones del ADNc fueron aisladas y luego trasladadas a bacterias tipo
coli que entonces produjeron, expresaron, grandes cantidades de dos proteínas
que realmente eran pequeñas extensiones de la proteína del gen Duchenne. Estas
proteínas acortadas fueron inyectadas en conejos, las cuales su cuerpo trató de
la misma manera que vacunas e hizo anticuerpos contra ellas. Después de unirles
marcadores fluorescentes a estos anticuerpos, entonces los equipos de
investigación de Ronald Worton en Canadá e Hideo Sugita en Japón, y también el
grupo de Kunkel, pudieron mostrar que la proteína estaba ubicada en la parte
interior de las membranas de la fibra muscular. Reveló su presencia allí
produciendo luz azulada fluorescente alrededor del borde de las fibras
musculares verticalmente cortadas bajo el microscopio, una técnica que todavía
es usada para demostrar la presencia de esta proteína Duchenne o su ausencia
en el tejido muscular.
Así que, un año después que el gen fue encontrado, la proteína que producía era
también conocida, que los investigadores nombraron distrofina. Y el gen no era
más el gen Duchenne desconocido sino el ahora conocido gen de la distrofina.
Estos descubrimientos condujeron al desarrollo de los métodos diagnósticos
moleculares. Jeffrey Chamberlain y su grupo usaron la nueva reacción en cadena
de polimerasa, PCR, para notar las supresiones o deleciones en el gen de la
distrofina y descubrieron que aproximadamente 65 % de los pacientes de Duchenne
tenían tales deleciones. Kevin Flanigan y otra vez el grupo de Kunkel empezó a
trabajar en los métodos de secuenciación de alta velocidad para detectar
mutaciones puntuales y otras mutaciones más raras en el gen.
Entonces Eric Hoffman se dio cuenta de que mientras que los pacientes de
Duchenne no tienen o tienen muy poca distrofina en sus músculos, los pacientes
de Becker tienen distrofinas alteradas, y mientras Anthony Mónaco trataba de
explicar este descubrimiento, le vino la hipótesis del marco de lectura en 1988,
que con algunas excepciones, ahora es la base probada para la tecnología de
omisión de exón. De hecho, este método que ahora es muy prometedor para
restaurar el marco de lectura, fue discutido y propuesto como un enfoque
terapéutico posible entre los investigadores ya en ese momento, pero nadie sabía
en ese entonces cómo eliminar exones del ARN mensajero.
Otra consecuencia importante del trabajo de Louis Kunkel y sus colegas fue la
detección de los genes para las varias distrofias musculares Del Anillo Óseo,
LGMD o Cinturas, porque cuando jalaron la distrofina afuera de los músculos con
anticuerpos, un algo grande numero de otras proteínas fueron sacadas también.
Como Kevin Campbell en Iowa City y Eijiro Ozawa en Tokio mostraron, ellas
pertenecían a un complejo de proteínas asociado con la distrofina el cual
anclaba a la distrofina al exterior de la membrana celular del músculo. Es ahora
conocido que las mutaciones en los genes de estas proteínas causan las formas
diferentes de LGMD.
Ahora, 26 años después de trabajar para encontrar el gen, Louis Kunkel todavía
está trabajando en distrofia muscular en el mismo hospital infantil en Boston,
concentrándose en las técnica de transferencia celular con mioblastos y otras
células madre de músculo que se muestran prometedoras para volverse métodos
terapéuticos en adición a las otras técnicas. Terminó su presentación con la
declaración: "Estamos en una etapa ahora donde ya no es desesperanzador para un
niño ahora nacido y diagnosticado con Duchenne”.
¿Por qué necesitamos pruebas clínicas?
En su primera presentación, Kate Bushby de la Universidad de Newcastle en Tyne
explicó que las pruebas clínicas eran mucho muy necesarias para el desarrollo de
un fármaco eficaz y que estas pruebas pueden tomar mucho tiempo. Pero los
chicos con Duchenne no tienen muchos años para esperar hasta que tales pruebas
sean realizadas y finalmente un fármaco sea desarrollado. Así que ellos y sus
padres deben comprender que los científicos que trabajan en una terapia eficaz
entienden su situación y están trabajando con los reguladores para asegurar que
los tratamientos eficaces puedan llegar a pruebas tan rápidamente como sea
posible. En interés de la familia y sus niños afectados, los científicos,
cuando ellos tienen una idea, una hipótesis, de cómo una terapia podría
funcionar, tienen que trabajar paso a paso, incluso antes de que una prueba
clínica pueda empezar, con el fin de tener certeza que cada paso de
investigación de respuestas validas en las que más investigación pueda basarse,
primero con pequeños animales de laboratorio, el ratón mdx por ejemplo, luego
con animales más grandes, el perro distrófico o simios, hasta que finalmente la
técnica desarrollada a través de estos pasos pueda ser probada en paciente
vivos, los chicos con Duchenne. Cualquieras errores, a veces causados por
atajos peligrosos, no pueden ser tolerados porque retrasarían el progreso de la
investigación por muchos años.
La distrofia muscular Duchenne es un trastorno complicado y los tratamientos
eficaces a largo plazo probablemente tendrán que actuar sobre la maquinaria
genética que hace distrofina en los músculos sanos pero no en los Duchenne. Tal
fármaco genético será probablemente un totalmente nuevo tipo de fármaco, capaz
de trabajar por un muy largo tiempo, para tratar los muchos kilos de músculos
de un chico, incluso los
interiores como aquellos de los pulmones y el corazón. Por lo tanto, las
demandas para la seguridad y la eficacia de tal fármaco para Duchenne son muy
severas.
Para comprender qué son las pruebas clínicas, Kate Bushby mencionó cuatro
reglas:
Regla 1: Las pruebas tratan de probar una hipótesis, que una idea tiene sentido.
Están ahí para contestar una pregunta para la que una respuesta es necesitada
por ejemplo "¿funciona este fármacos para curar la DMD?" y no necesariamente
dan la respuesta esperada. Tal hipótesis debe estar basada en buenos datos
preliminares confiables.
Regla 2: Ser un participante en una prueba no debe ser un sustituto para recibir
el mejor cuidado disponible. Uno no debe dejar todo lo que uno sabe, después de
todo, una prueba podría no funcionar.
Regla 3: El diseño de una prueba es determinado por la naturaleza de la
hipótesis a responder. Podría ser una prueba piloto, abierta, método ciego, o
doble-ciego controlado con placebo. El número de pacientes participantes depende
de qué grado de la confiabilidad de datos sea necesitado para responder a la
pregunta, más participantes hacen los resultados más precisos y más confiables.
Generalmente, las pruebas tienen que pasar a través de tres fases, y es
importante notar que en las fases I y II los participantes en la prueba no
pueden en realidad experimentar mejora ya que estas clases de pruebas son hechas
para responder solo preguntas sobre seguridad y de limitada eficacia: (1) fase I
para probar la toxicidad, (2) fase II para probar la eficacia, la dosificación y
la seguridad, y (3) fase III para confirmar un efecto positivo relevante
clínicamente y determinar la dosis óptima. Las pruebas con niños que tienen una
enfermedad progresiva como la DM Duchenne son un reto, tienen que ser
diseñadas muy cuidadosamente porque los niños pequeños con DMD crecen y se
ponen mejor incluso sin un fármaco.
Regla 4: La supervisión y regulación impuesta por autoridades diferentes están
ahí para proteger a los pacientes de un daño y también a sus médicos de las
consecuencias legales de un tratamiento posiblemente peligroso. Las
consideraciones éticas son más que solo las cuestiones del consentimiento de
los padres y los pacientes mismos, pero también tienen que asegurar que una
prueba es adecuada para responder la pregunta que está siendo hecha. Las
regulaciones también deben asegurar la consistencia y exactitud de los datos
para las aprobaciones reguladoras siguientes y final. El papeleo extensivo, las
largas demoras, y el gasto algo grande de los ensayos clínicos asegura de que
todo se haga correctamente.
Las pruebas clínicas para encontrar una terapia para Duchenne presentan varios
problemas especiales: (1) Esta enfermedad es rara, por lo tanto la industria
farmacéutica no siempre esta interesada, pero su participación es necesaria
para el desarrollo de un fármaco. También necesitan un motivo de ganancia para
atraer capital suficiente, así como la regulación de enfermedad-huérfana para
deducción de impuestos es importante. (2) Debido a que la distrofia Duchenne es
algo rara, los pacientes con mutaciones específicas en su gen de la distrofina
serán escasos, a menudo causado por la falta de diagnóstico molecular completo.
Así que los padres deben insistir en que la mutación exacta en el gen de la
distrofina de su hijo afectado sea determinada lo antes posible. (3) El
establecimiento de registros con los datos de diagnósticos completos de tantos
pacientes como sea posible de todas partes del mundo sería una ventaja tremenda
para el diseño de las futuras pruebas, y las familias deben ser animadas a
enterarse de la existencia de tales registros e inscribir a su hijo. (4) Una
real cultura de pruebas entre la comunidad de familias Duchenne, doctores, y
científicos con cooperación internacional debe ser desarrollada en tantos
países como sea posible. Hay un nuevo esfuerzo de colaboración internacional
dirigido por Kate Bushby y su colega Volker Straub - TREAT-NMD:
www.treat-nmd.eu
– que esperanzadoramente acelerará el progreso de moléculas prometedoras en las
pruebas y los tratamientos.
Hay mas pruebas clínicas negativas que positivas, así que ningún paciente debe
detener o descuidar la mejor atención médica posible que ya está disponible. Por
la misma razón, no tiene sentido recorrer grandes distancias para tomar parte en
una prueba cuando todavía no hay ninguna idea si va a dar un resultado
positivo. El consentimiento debe siempre ser dado voluntariamente después de la
explicación completa de todos los detalles positivos y negativos. Las
discusiones con los científicos y los médicos deben ser siempre posibles, y a
los padres debe permitírseles retractarse de que su hijo afectado participe en
la prueba en cualquier momento sin tener que defender su decisión.
Kate Bushby dijo finalmente: Solamente las pruebas clínicas correctamente
diseñadas y llevadas a cabo traerán una terapia efectiva dentro de un tiempo
razonable. Los errores deben ser evitados a todo costo: podrían retrasar
esfuerzos enteros de investigación y prolongarían el tiempo que los niños
tienen que esperar para un cambio decisivo y positivo de su futura vida.
Omisión de exón.
Cómo trabaja la omisión de exón: La omisión de exón es una de las técnicas
terapéuticas potenciales que ya esta siendo probada clínicamente en pacientes
con Duchenne. En su presentación introductoria, Steve Wilton de la Universidad
de Australia Occidental en Perth, describió esta técnica en detalle. Los
lectores de este informe que no están familiarizado con la bioquímica de cómo
los genes hacen las proteínas, de la estructura y la función del gen de la
distrofina y la proteína distrofina, y cómo las mutaciones causan distrofia
Duchenne, deben por favor primero leer los capítulos introductorios del informe
sobre la reunión del Parent-Project en Cincinnati/ Ohio en Julio del 2006. Este
informe está disponible en inglés, alemán, y español en Internet en
www.duchenne-research.com.
La técnica de omisión de exón trata de transformar una mutación Duchenne en una
mutación Becker, así la gravedad es reducida. Si una mutación altera el marco
de lectura y por lo tanto causa distrofia Duchenne, el marco de lectura puede
ser corregido retirando artificialmente del ARN mensajero uno o más exones
directamente antes o después de la deleción, duplicación, o el exón que contiene
una mutación puntual. En el último caso, el retiro de un solo exón mutado puede
evitar el defecto, o podría ser necesario retirar uno o más exones cercanos
para mantener el marco de lectura.
Los exones pueden ser eliminados del ARNm con oligorribonucleótidos en
antisentido, AONs. Ellos son cortas estructuras de ARN que constan de 20 a 30
nucleótidos cuyas secuencias son construidas en tal manera que ellos mismos por
emparejamiento Watson-Crick de bases se unían solamente a la secuencia
complementaria dentro del exón a ser retirado o a las regiones de sus fronteras.
En antisentido quiere decir que su secuencia de bases está en el orden
contrario a la secuencia objetivo en el ARNpre-m. Estos AONs interfieren así con
la maquinaria de empalmado con el fin de que los exones seleccionados no sean
más incluidos en el ARNm por lo tanto, son omitidos.
El empalmado de los exones del ARNpre-m al ARNm es un procedimiento muy
complicado y preciso mediado por un complejo de muchas proteínas que reconocen
las fronteras entre los exones y los intrones. Los AONs tienen que tener una
secuencia de nucleótidos suficientemente larga con el propósito de inhibir el
empalmado de solamente esos exones seleccionados que son necesarios para
devolver el marco de lectura al ARNm de la distrofina defectuoso. Actualmente
son conocidos 231,677 exones de los aproximadamente 23,000 genes humanos. El
proceso de omisión de exón, por lo tanto, tiene que ser sumamente específico y
preciso. Si los AONs causaran omisión de exón en otros genes, efectos
secundarios peligrosos serían la consecuencia.
La omisión de exón no altera el gen mismo con su mutación, pero su ARNm no
contiene más la información del exón o exones omitidos, y ni tampoco de los
exones delecionados. Esta terapia afecta cómo es leído y procesado el gen
defectuoso. Como este ARNm omitido es más breve de lo normal, la proteína
distrofina es también más corta, contiene menos aminoácidos. Si los aminoácidos
faltantes forman parte de regiones no-esenciales de la distrofina, como los
dominios de la varilla central (central rod), la proteína más corta puede a
menudo todavía llevar a cabo su papel estabilizador en la membrana celular del
músculo. El resultado sería el cambio de síntomas severos Duchenne a síntomas
mucho más leves de distrofia muscular Becker.
Los oligorribonucleótidos son pequeños trozos de ARN - oligo significa pocos.
Los nucleótidos son los componentes básicos de los ácidos nucleicos. Constan de
tres unidades moleculares: una ribosa, una base, y un fosfato. Así que hay
cuatro ribonucleótidos diferentes. Lo dos tipos de AONs que son mayormente
usados en la omisión de exón, son oligorribonucleótidos protegidos con el
propósito de que no sean destruidos en las células musculares por nucleasas,
enzimas, que destruyen ácidos nucleicos.
Los científicos holandeses están usando los 2'O-metil-fosfotioatos, también
llamados metil-tioatos o 2O-metilos. Ellos tienen un grupo metilo, un carbono
con tres átomos de hidrógeno, unido al oxígeno del segundo carbono de las
unidades de ribosa y un átomo de azufre en lugar de uno de los átomos de oxígeno
de los grupos de fosfato. Los morfolinos, que los investigadores australianos
han encontrado más prometedores, y que los británicos usarán en su prueba
planeada, tienen uno de los oxígenos del fosfato reemplazado con un grupo
dimetil ámido, un nitrógeno con dos grupos metilos, y las unidades enteras de
ribosa son reemplazadas por anillos morfolinos, seis anillos unidos, cada uno
consiste de cuatro átomos de carbono, uno de oxígeno y un átomo de nitrógeno con
átomos de hidrógeno unidos a los carbonos.
En el laboratorio del Dr. Wilton, AONs morfolinos están siendo desarrollados,
probados, y optimizados, para que todos los exones de la distrofina puedan ser
omitidos, uno solo o varios al mismo tiempo, en cultivos de células musculares
normales y distróficas de ratón, perro, y humano. Algunos exones son omitidos
más fácilmente que otros. Los exones que son difíciles de retirar del ARNm
necesitan concentraciones más altas de AONs, pero el trabajo continúa para
optimizar sus estructuras. Los AONs Morfolinos son probablemente muy seguros en
los humanos, porque ya han sido evaluados en adultos, no en niños, como
antibióticos para destruir virus.
La omisión de exón no será una cura para distrofia Duchenne, deberá reducir la
severidad de sus síntomas al convertirla en distrofia Becker con una mejor
prognosis. Esto probablemente beneficiará hasta un 80 % de todos los pacientes
con Duchenne. Los primeros estudios clínicos, uno usando 2O-metilos y el otro
morfolinos como se describe abajo, se dirigirán al exón 51 localmente en un
solo músculo para establecer el principio de prueba. Pruebas sistémicas con
inyecciones de los AONs en la circulación sanguínea seguirían pronto. Los
investigadores continuarán trabajando para evaluar ambas clases de AONs
clínicamente, porque al poder ocurrir resultados negativos en futuras pruebas
clínicas con un tipo de AON hará aconsejable no usarlo en estudios a largo
plazo. Incluso es concebible que combinaciones de ambos tipos de AON podrían
ser usadas en el futuro.
Muchos detalles sobre la omisión de exón fueron hablados en una entrevista con
Steve Wilton que era parte del informe de la reunión de Cincinnati. Ese informe
contiene también en su última página un ejemplo detallado de la omisión del
exón 46 para devolver el marco de lectura después de la deleción del exón 45.
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4ta Conferencia Internacional en Londres, 21 y 22 de Octubre del 2006